Dwell-bewaking van de cel heid op metabolisme en mitochondriale ademhaling in 3D cel cultuur systeem met behulp van NMR-spectroscopie
Achtergrond: Vanwege het samenspel tussen mitochondriale ademhaling en cellulair metabolisme, levert de gelijktijdige monitoring van beide cellulaire processen belangrijke inzichten op voor het begrijpen van biologische processen. NMR-stroomsystemen bieden een uniek venster in het metaboloom van gekweekte cellen. Vereenvoudigde bioreactorconstructie op foundation van in de handel verkrijgbare stroomsystemen verhoogt de uitvoerbaarheid en reproduceerbaarheid van bioreactoronderzoeken met behulp van standaard NMR-spectrometers. We streven daarom naar het opzetten van een reproduceerbaar NMR-bioreactorsysteem voor metabolisch 1H-NMR-onderzoek van kleine moleculen en gelijktijdige bepaling van de oxygenatie door 19F-NMR, met een diepgaande beschrijving en validatie door begeleidende maatregelen.
Methoden: We demonstreren een gedetailleerde en gestandaardiseerde workflow voor de voorbereiding en overdracht van op collageen gebaseerde 3D-celkweek met hoge celdichtheid voor geperfundeerd onderzoek in een 5 mm NMR-buis. Zelfgebouwd gasmengstation maakt 5% CO2-atmosfeer mogelijk voor fysiologische pH in op koolstof gebaseerd medium en wordt geperfuseerd door HPLC-pomp.
Resultaten en discussie: Geïmplementeerde geperfuseerde bioreactor maakt detectie mogelijk van perfusiesnelheidafhankelijke metabolietinhoud. We tonen interleaved dynamische profilering van 26 metabolieten en mitochondriale ademhaling. Tijdens constante perfusie duidde opeenvolgende injectie van rotenon/oligomycine en 2-deoxyglucose op onmiddellijke activering en deactivering van de glycolytische snelheid en volledige remming van het zuurstofverbruik. We toonden gevoeligheid voor het detecteren van substraatafbraaksnelheden van belangrijke mitochondriale brandstofroutes en waren in staat om gelijktijdig het cellulaire zuurstofverbruik te meten.
Description: Recombinant Rat bFGF is a disulfide-linked homodimeric protein consisting of 146 amino acid residues, and migrates as an approximately 16 kDa protein under non-reducing and reducing conditions in SDS-PAGE. Optimized DNA sequence encoding rat basic Fibroblast Growth Factor mature chain was expressed in E. coli.
Description: Recombinant Rat bFGF is a disulfide-linked homodimeric protein consisting of 146 amino acid residues, and migrates as an approximately 16 kDa protein under non-reducing and reducing conditions in SDS-PAGE. Optimized DNA sequence encoding rat basic Fibroblast Growth Factor mature chain was expressed in E. coli.
The protein encoded by FGF2 gene is a member of the fibroblast growth factor (FGF) family. FGF family members bind heparin and possess broad mitogenic and angiogenic activities. This protein has been implicated in diverse biological processes, such a
Description: Quantitative sandwich ELISA for measuring Human bFGF in samples from cell culture supernatants, serum, whole blood, plasma and other biological fluids.
The protein encoded by FGF2 gene is a member of the fibroblast growth factor (FGF) family. FGF family members bind heparin and possess broad mitogenic and angiogenic activities. This protein has been implicated in diverse biological processes, such a
Description: Quantitative sandwich ELISA for measuring Human bFGF in samples from cell culture supernatants, serum, whole blood, plasma and other biological fluids.
The protein encoded by FGF2 gene is a member of the fibroblast growth factor (FGF) family. FGF family members bind heparin and possess broad mitogenic and angiogenic activities. This protein has been implicated in diverse biological processes, such a
Description: Quantitative sandwich ELISA for measuring Human bFGF in samples from cell culture supernatants, serum, whole blood, plasma and other biological fluids.
Een nieuwe werkwijze voor de studie van biochemische en morfologische parameters 3D cell cultures : Analysis in LoVo sferoïden behandeld met crizotinib
Driedimensionale (3D) kweeksystemen zoals tumorsferoïden vertegenwoordigen bruikbare in vitro-modellen voor het screenen van geneesmiddelen en meer in het algemeen voor kankerbiologisch onderzoek, maar het genereren van uniforme populaties van sferoïden blijft een uitdaging. De mogelijkheid om sferoïde eigenschappen goed te karakteriseren zou de betrouwbaarheid van deze modellen vergroten. Om dit probleem aan te pakken, werden verschillende analyses gecombineerd: i) een nieuw apparaat en een relatieve analytische methode voor de nauwkeurige, gelijktijdige en snelle meting van massadichtheid, gewicht en grootte van sferoïden, ii) confocale beeldvorming, en iii) eiwitkwantificering, in een klinisch related 3D-model. De LoVo colonkankercellijnsferoïden vormend, behandeld met crizotinib (CZB), een ATP-competitieve kleine-molecuulremmer van de receptortyrosinekinasen, werd gebruikt om de correlatie tussen biofysische en morfologische parameters in zowel levende als vaste cellen te bestuderen en te beoordelen.
De nieuwe op vloeistof gebaseerde metingen maakten een robuuste fenotypische karakterisering van de sferoïdenstructuur mogelijk, wat inzicht biedt in de bulk van de sferoïden en een nauwkeurige meting van de tumordichtheid. Deze analyse helpt de technische limieten te overwinnen van de beeldvorming die nauwelijks de dikte van 3D-structuren doordringt. Dienovereenkomstig waren we in staat om te documenteren dat CZB-behandeling een affect heeft op de massadichtheid, wat een belangrijke marker is die de behandeling van kankercellen kenmerkt. Sferoïde cultuur is de ultieme technologie voor het ontdekken van geneesmiddelen en de goedkeuring van een dergelijke nauwkeurige meting van de tumorkenmerken kan een belangrijke stap voorwaarts betekenen voor het nauwkeurig testen van het potentieel van de behandeling in 3D in vitro-modellen.
De rol van de embryonale Chick Muscle Cell Tradition in de studie van Skeletal myogenese
De mechanismen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van skeletspiervezels zijn de afgelopen 70 jaar bestudeerd en toch zijn veel aspecten van dit proces nog steeds niet volledig begrepen. Een groot aantal in vivo en in vitro modellen van ongewervelde en gewervelde dieren is gebruikt voor het ontleden van de moleculaire en cellulaire gebeurtenissen die betrokken zijn bij spiervorming. Tot de meest gebruikte diermodellen voor de studie van myogenese behoren de knaagdieren rat en muis, de fruitvlieg Drosophila en de vogels kip en kwartel. Hier beschrijven we de robuustheid en voordelen van het kuiken primaire spiercultuurmodel voor de studie van skeletmyogenese. In de myoblastcultuur verkregen uitembryonale kippectoralisspier is het mogelijk om alle stappen te analyseren die betrokken zijn bij skeletmyogenese, zoals myoblastproliferatie, terugtrekking uit de celcyclus, celverlenging en -migratie, myoblastuitlijning en -fusie, de assemblage van dwarsgestreepte myofibrillen en de vorming van multinucleaire myotubes.
Het feit dat in vitro kippenmyotubes honderden kernen kunnen bevatten, terwijl myotubes van cellijnen slechts een dozijn kernen hebben, toont het hoge niveau van differentiatie van het autonome kippenmyogene programma aan. Deze opvallende differentiatie is onafhankelijk van serumonttrekking, wat wijst op de kracht van het mannequin. We bekijken ook de belangrijkste pro-myogene en anti-myogene moleculen en signaalroutes die betrokken zijn bij myogenese van kippen, naast het verstrekken van een gedetailleerd protocol voor de bereiding van embryonale myogene culturen van kippen. Bovendien hebben we een bibliometrischeanalyse van de artikelen die dit mannequin gebruikten om te evalueren welke de belangrijkste onderzochte onderwerpen van belang waren en hun bijdragers. We verwachten dat door het beschrijven van de belangrijkste bevindingen, en hun voordelen, van de research met behulp van het embryonale kuiken myogene mannequin, we nieuwe research zullen bevorderen over het moleculaire en cellulaire proces dat betrokken is bij spierproliferatie en differentiatie die meer lijken op de werkelijke in vivo toestand dan de spiercellijnen.
Genereren van cardiomyocyten onder de atrioventriculaire knoop cellen langlopende kweken
De omzet van pacemakercellen kan optreden tijdens de levensduur van het lichaam, en we hebben onlangs de hypothese naar voren gebracht dat gespecialiseerde hartcellen het potentieel hebben om cardiomyocyten te genereren uit fibroblasten. Om deze hypothese te onderzoeken, analyseerden we het vermogen van atrioventriculaire knoopcellen (AVNC’s) om functionele cardiomyocyten te genereren in een langetermijncultuur. AVNC’s werden geïsoleerd uit volwassen cavia-harten en gedurende maximaal drie weken gekweekt. Onder fasecontrast-microscopische observatie in de loop van de tijd, bleek dat binnen een week een aantal fibroblasten zich rond de AVNC’s verzamelden en celclusters vormden, en daarna begonnen de celclusters spontaan te kloppen. De ontluikende celclusters breidden hun gebied geleidelijk uit met drie weken in kweek en brachten specifieke cardiale genen en eiwitten tot expressie.
De rijping van nieuw gevormde cardiomyocyten lijkt traag te zijn in culturen van AVNC’s in vergelijking met die van sinoatriale knoopcellen. Stimulatie van muscarinereceptoren met acetylcholine veroorzaakte een afname van de slagsnelheid die werd geblokkeerd door atropine , en activering van adenylaatcyclase-activiteit met forskoline verhoogde de slagsnelheid, terwijl stimulering van bèta-adrenoceptoren door isoproterenol geen impact had. Deze resultaten geven aan dat AVNC’s een cluster van cellen vormen met eigenschappen van functionele cardiomyocyten en leveren bewijs om de hypothese te ondersteunen.